УДК 616.72-002.77+616.24-003.661] +004.94:599.32

 

О. Ю. Ніколенко

 

ПОРУШЕННЯ КЛІТИННОГО ІМУНІТЕТУ У ЩУРІВ

З МОДЕЛЛЮ СИНДРОМУ КОЛІНЕ-КАПЛАНА

 

Донецький національний медичний університет, м. Донецьк, Україна

 

Реферат. О. Ю. Николенко. НАРУШЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА У КРЫС С МОДЕЛЬЮ СИНДРОМА КОЛИНЕ-КАПЛАНА. У крыс с моделью синдрома Колине-Каплана наблюдается снижение фагоцитарной активности в НСТ-тесте и в реакции фагоцитоза со стафилококком штамм 209. При исследовании сыворотки крови крыс наблюдается повышение уровня противовоспалительных интерлейкинов 6 и 10, а также повышение циркулирующих иммунных комплексов.

Ключевые слова: синдром Колине-Каплана, фагоцитоз, интерлейкин, циркулирующие иммунные комплекс.

 

Реферат. О. Ю. Ніколенко ПОРУШЕННЯ КЛІТИННОГО ІМУНІТЕТУ У ЩУРІВ З МОДЕЛЛЮ СИНДРОМУ КОЛІНЕ-КАПЛАНА. У щурів з моделлю синдрому Коліне-Каплана спостерігається зниження фагоцитарної активності в НСТ-тесті та в реакції фагоцитозу зі стафілококом штам 209. При дослідженні сироватки щурів виявляється підвищення рівня протизапальних інтерлейкінів 6 та 10, а також підвищення кількості циркулюючих імунних комплексів.

Ключові слова: синдром Коліне-Каплана, фагоцитоз, інтерлейкін, циркулюючі імунні комплекс

 

Summary. O. Yu. Nikolenko. VIOLATION OF CELLULAR IMMUNODEFENCE FOR RATS WITH MODEL OF SYNDROME COLINET-CAPLAN. In the rats with the model of Colinet-Caplan’s syndrome the decrease of phagocytic activity in the NST-test and in response of phagocytosis with  staphylococcus 209 strain is watched. At the examination of  the rats’ blood serum the increase of antiinflammatory interleukins 6 and 10 level, and an increase of circulating cell-bound immune complexes is watched, as well.

Key words: syndrome of Colinet-Caplan, phagocytosis, interleukin, circulating cell-bound immune complexe.

 

 

У 1950 році бельгійський лікар Colinet уперше описав ревматоїдний артрит у жінки, яка страждала силікозом. Через 3 роки у Великобританії Caplan звернув увагу на часте поєднання силікозу з ураженням суглобів у шахтарів [1]. Аутоімунні захворювання супроводжуються відхиленням нормального перебігу апоптозу клітин організму людини. Надлишкове накопичення апоптичних клітин через порушення їх утилізації фагоцитами за участю комплементу призводить до зміни спектру домінуючих цитокинів з прозапальних IL-1 та TNF-альфа на протизапальні IL-4, IL-10, що сприяє тривалому підтриманню імунної відповіді Th2-типу [2]. Сучасні уявлення про патогенез як силікозу, так і ревматоїдного артриту дозволяють стверджувати, що синдром Коліне - Каплана – єдине захворювання, яке починається з розвитку пневмоконіозу під впливом вільного двоокису кременю, потім виникають імунологічні порушення, що призводять до ревматоїдного артриту, який, в свою чергу, супроводжується ураженням легень з розвитком ревматоїдних вузликів в інтерстиції. Формування цих вузликів обумовлено присутністю часточок пилу в альвеолярних макрофагах [3].

В останні роки було показано, що процеси біологічного захисту організму, в тому числі й фагоцитоз, безпосередньо пов’язані з утворенням в клітинах активних форм кисню. При пиловій патології легень «респіраторний вибух» здатен не лише зруйнувати коніофаг, але й запустити аутоімунні механізми. Утворення активних форм кисню та розвитку в коніофагах енергодефіцитного стану та внутрішньоклітинної гіпоксії визначає неефективність антимікробного імунітету, особливо при взаємодії фіброгенного промислового пилу з високим вмістом діоксиду кремнію, який має властивості імунологічного адьюванту [4].

Матеріал і методи. В експерименті використані дві групи щурів – самців лінії «Вістар» з масою тіла 200-250 гр.: 1 група – здорові тварини (25 щурів), 2 група – тварини з моделюванням синдрому Коліне-Каплана (тварині в корінь хвоста вводили повний ад'ювант Фрейнда. На 7-му добу тварині вводили 1 мл суспензії вугільно-порідного пилу з розрахунку 50 мг пилу на одного щура. На 15 і 34 добу в корінь хвоста щуру вводили повний ад'ювант Фрейнда 0,5 мл. На 29 і 40 добу вводили цитостатик – азатіоприн в дозі 50 мг/кг, а з 16 по 29 добу та з 43 по 49 добу вводили метилурацил в дозі 0,2 г/кг). Дослідження проводилось 49 діб. Через 10 діб після останнього введення метилурацилу тварин забивали під ефірним наркозом.

При декапітації тварин проводили забір крові, готували мазки, фіксували у метанолі, потім фарбували за Романовським. Лейкоцитарну формулу у мазках підраховували на 200 клітин. Для визначення кількості лейкоцитів використовували камеру Горяєва, після чого визначали в крові відносну та загальну кількість лімфоцитів [5].

Інтерлейкіни 6 і 10 визначали в сироватці крові методом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням тест-систем виробництва ООО «Цитокін» Санкт-Петербург (Російська Федерація). В наборі «ІФА-Іл-10» використовували «сендвіч» – варіант твердофазного імуноферментного аналізу.

Існує багато способів для визначення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), але найбільше розповсюдження отримав метод преципітації з розчином поліетиленгліколю (ПЕГ) 6000. Розчин поліетиленгліколю здатний осадити з сироватки імунні комплекси та викликати їх преципітацію. 3,5 % ПЕГ флокулює найбільш розповсюджені «проміжні комплекси середніх розмірів». Тому для преципітації використовували 3,5 % ПЕГ. Рівень ЦІК вимірювали на спектрофотометрі ФЕК-56 та виражали в одиницях оптичної щільності [5].

Для визначення фагоцитарної активності нейтрофілів периферичної крові хворих використовували добову тест-культуру стафілококу штам 209. При мікроскопічному досліджені (рахували не менш як 200 клітин) проводили розрахунок фагоцитарного індексу через 30 та 90 хв. (фагоцитарний індекс (ФІ) – відсоток клітин, які вступили до фагоцитозу, від загальної кількості) та фагоцитарного числа (ФЧ) через 30 та 90 хв. (ФЧ – середня кількість бактерій, що розташовані внутрішньоклітинно) [5].

Киснезалежний метаболізм нейтрофілів вивчали за допомогою тесту з нітросинім тетразолієм (НСТ). При зіткненні з активізованим нейтрофілом НСТ оновлювався в диформазан, який у вигляді гранул, нерозчинних у воді та органічних розчинниках, відкладається всередині та на поверхні клітин. Кількість диформазану, що випав, була критерієм інтенсивності реакції. Після мікроскопії підраховували відсоток нейтрофілів, що містять диформазан, а також індекс активації нейтрофілів (ІАН) [6].

Для обробки результатів дослідження проводили розрахунки за допомогою параметричних та непараметричних методів статистики. Також використовували кореляційний та регресійний методи аналізу з оцінкою середнього значення (), їх помилки (S), критерія Стьюдента (S), медіанного критерію (Мt), Манна-Уітні (MW) достовірності статистичних показників (р) на комп’ютері SAMSUNG (R 20) за допомогою ліцензійного пакету «Statistica 5,5» (Start Soft Rus) [7].

Результати досліджень. При порівнянні показників аналізу крові у тварин з моделлю синдрому Коліне - Каплана й контрольної групи значно відрізнялись. Середня кількість лейкоцитів у щурів з моделлю синдрому Коліне-Каплана була статистично значно менша (7,1±0,20) Г/л (гіга/літр або 109/л) при порівнянні з контролем (9,01±0,37) Г/л (MW=4,29, р<0,001, Мt=15,71, р<0,001, S=4,57, р<0,001). Кількість лейкоцитів зменшувалась у тварин з моделлю Коліне-Каплана за рахунок зменшення у них у крові абсолютного вмісту паличкоядерних нейтрофілів – (0,11±0,01) Г/л при порівнянні з контрольною групою (0,40±0,04) Г/л (MW=5,46, р<0,001, Мt=35,28, р<0,001, S=7,10, р<0,001). Абсолютна кількість сегментоядерних нейтрофілів складала (1,64±0,06) Г/л, що відрізнялось від контролю (1,21±0,17) Г/л (MW=2,39, р=0,016, Мt=6,48, р=0,011, S=2,30, р=0,027). На відміну від контролю (0,21±0,05) Г/л, у експериментальних тварин була знижена абсолютна кількість еозинофілів (0,04±0,01) Г/л (MW=3,33, р<0,001, Мt=9,68, р=0,002, S=3,32, р=0,002). Абсолютна кількість базофілів складала у дослідних тварин (0,07±0,06) Г/л, а в контролі (0,07±0,02) Г/л (MW=0,20, р=0,848, Мt=0,00, р=1,000, S=0,19, р=0,853), не відрізняючись між собою, абсолютна кількість лімфоцитів у модельних тварин складала (5,00±0,16) Г/л, що відрізнялась від контролю (6,29±0,36) Г/л (MW=2,75, р=0,005, Мt=6,48, р=0,01, S=3,27, р=0,002) відповідно. Абсолютна кількість моноцитів складала (0,23±0,03) Г/л, у контролі (0,81±0,1) Г/л (MW=4,55, р<0,001, Мt=18, р<0,001, S=5,69, р<0,001), що значно відрізнялась між собою.

Відносна кількість паличкоядерних нейтрофілів в групах у експериментальних та здорових щурів складала (1,6±0,11) % та (4,56±0,44) % (MW=4,83, р<0,001, Мt=29,64, р<0,001, S=6,51, р<0,001), відрізняючись між собою. Відносне значення еозинофілів у дослідних тварин складало (0,60±0,13) % та у контролі (2,44±0,57) % (MW=2,83, р=0,004, Мt=8,42, р=0,004, S=3,17, р=0,003), відрізняючись між собою. Відносна кількість сегментоядерних нейтрофілів у хворих тварин складала (23,24±0,83) % та у здорових тварин (13,36±1,81) % (MW=3,42, р<0,001, Мt=6,52, р=0,011, S=4,95, р<0,001), достовірно відрізняючись. Відносна кількість базофілів у тварин з моделлю пневмоконіозу (1,00±0,27) % не відрізнялась від контролю (0,84±0,24) % (MW=0,21, р=0,830, Мt=0,00, р=1,000, S=0,44, р=0,662). Відносна кількість лімфоцитів в групах складала (70,40±1,06) % та в контролі (69,88±2,57) % (MW=1,07, р=0,288, Мt=1,28, р=0,26, S=0,19, р=0,186), достовірно не відрізнялась. Відносне значення моноцитів складало у модельних тварин (3,16±0,39) % та у здорових тварин (8,92±1,00) % (MW=4,30, р<0,001, Мt=13,52, р<0,001, S=5,36, р<0,001), що значно відрізнялось.

Однією з ланок гуморального і клітинного імунітету є фагоцитарна ланка. При порівнянні показників фагоцитарної активності нейтрофілів через 30 хвилин у тварин дослідної групи становила (18,72±0,62) %, відрізняючись від контролю (23,43±0,04) % (MW=6,06, р<0,001, Мt=50,00, р<0,001, S=7,56, р<0,001). Фагоцитарне число у тварин із моделлю синдрому Коліне-Каплана через 30 хвилин було (5,32±0,23), відрізняючись від контролю (6,73±0,07) (MW=4,07, р<0,001, Мt=18,00, р<0,001, S=5,77, р<0,001), фагоцитарна активність у хворих тварин через 30 хвилин була значно менша (18,72±0,62) % у порівнянні з контрольними щурами (23,43±0,04) % (MW=6,06, р<0,001, Мt=50,00, р<0,001, S=7,56, р<0,001), фагоцитарна активність у хворих тварин через 90 хвилин була (18,96±0,61) %, яка відрізнялась від контролю (23,66±0,04) % (MW=6,01, р<0,001, Мt=46,15, р<0,001, S=7,73, р<0,001), а фагоцитарне число у модельних тварин через 90 хвилин становило (5,46±0,45), відрізняючись від контролю (6,91±0,07) (MW=1,49, р=0,135, Мt=0,73, р=0,39, S=3,46, р<0,001) відповідно тільки за критерієм Стьюдента. З цих даних видно, що у тварин із моделлю синдрому Коліне-Каплана знижені показники фагоцитозу нейтрофілів. Це може свідчити про участь цих клітин в імунопатологічних процесах (рис. 1).

Рис.1.Фагоцитарна активність нейтрофілів крові за фагоцитозом стафілококу штам 209 у щурів з пневмоконіозом та в контролі

Примітка: 1 - фагоцитарна активність нейтрофілів через 30 хвилин (%); 2 - фагоцитарне число через 30 хвилин (стафілококів); 3 - фагоцитарна активність нейтрофілів через 90 хвилин (%); 4 - фагоцитарне число через 90 хвилин (стафілококів).

Групи: - модель пневмоконіозу; - контроль

 

З цих даних видно, що у тварин із моделлю синдрому Коліне-Каплана знижені показники фагоцитозу нейтрофілів. Це може свідчити про участь цих клітин в імунопатологічних процесах, а також про блокування рецепторів фагоцитів антитілами й імунними комплексами. Тому ми визначали рівень імунних комплексів у хворих тварин (105,88±2,45) од.опт.щільності, який був значно більшим, ніж у здорових щурів (69,28±3,80) од.опт.щільності (MW=5,61, р<0,001, Мt=28,88, р<0,001, S=8,10, р<0,001). Ці дані показують системний характер ураження імунітету при синдромі Коліне-Каплана.

Розвиток захворювання по типу синдрому Коліне-Каплана впливав на зменшення фагоцитарної активності нейтрофілів зі стафілококом 209 через 30 хвилин (КW=37,01, р<0,001), фагоцитарного числа через 30 хвилин (КW=16,58, р<0,001), фагоцитарної активності нейтрофілів зі стафілококом 209 через 90 хвилин (КW=36,37, р<0,001), а також на збільшення рівня циркулюючих імунних комплексів (кКW=31,46, р<0,001).

При порівнянні здатності нейтрофілів до кисневозалежного метаболізму за НСТ-тестом встановлено, що у модельних тварин вона значно менша (37,80±3,76) % у порівнянні з контролем (82,96±3,41) % (MW=5,53, р<0,001, Мt=35,28, р<0,001, S=8,89, р<0,001) відповідно.

Індекс активації нейтрофілів без стимуляції складав у хворих тварин (0,61±0,06), відрізняючись від контролю (1,87±0,10) (MW=5,68, р<0,001, Мt=42,32, р<0,001, S=10,64, р<0,001) відповідно. Таким чином, при синдромі Коліне-Каплана фагоцити мають низьку резервну активність внутришньоклітинних ферментів, що може призводити до загибелі нейтрофілів під час їх активації та розвитку дефіциту фагоцитарної ланки імунної системи.

Розвиток захворювання по типу синдрому Коліне-Каплана впливав на зниження здатності нейтрофілів до кисневозалежного метаболізму за НСТ-тестом (КW=30,60, р<0,001), індексу активації нейтрофілів без стимуляції (КW=32,22, р<0,001).

При порівнянні кількісного складу інтерлейкинів 6,10 у тварин з моделлю синдрому Коліне-Каплана і контрольної групи їх вміст значно відрізнявся.

Рівень IL-6 у щурів із моделлю синдрому Коліне-Каплана (51,26±1,50) пг/мл був значно вищим, ніж контрольній групі (43,27±2,57) пг/мл (MW=2,05, р<0,001, Мt=2,00, р=0,16, S=2,69, р=0,01) відповідно. Підвищений рівень IL-6 може привести до стимуляції проліферації фібробластів та формуванню фіброзного запалення. А також цей цитокін підсилює проліферацію та диферинцировку В-клітин, що може привести до збільшення імунних комплексів та зниження фагоцитарної функції нейтрофілів. Нами одержані достовірні дані про збільшення концентрації IL-10 в сироватці крові у щурів з моделлю синдрому Коліне-Каплана (57,13±1,56) пг/мл в порівнянні з контрольною групою (49,44±2,55) пг/мл (MW=2,18, р<0,001, Мt=3,92, р=0,05, S=2,57, р=0,013) відповідно. Підвищений рівень протизапального цитокину IL-10 може підтримувати хронічне запалення при синдромі Коліне-Каплана. А також цей цитокин підсилює проліферацію та диференціювання В-клітин, що може привести до збільшення рівня імунних комплексів та зниження фагоцитарної функції нейтрофілів.

Висновки

1.                   У щурів з моделлю синдрому Коліне-Каплана спостерігалось значне зменшення кількості лейкоцитів крові, а також зсув лейкоцитарної формули вліво.

2.                   При дослідженні крові щурів з моделлю синдрому Коліне-Каплана було виявлено зниження фагоцитарної активності нейтрофілів в реакції фагоцитозу зі стафілококом штам 209 та в НСТ-тесті.

3.                   У щурів з моделлю синдрому Коліне-Каплана в сироватці крові було виявлено підвищення протизапальних інтерлейкінів 6 та 10, що може свідчити про хронічний перебіг запалення.

4.                   Рівень імунних комплексів у хворих тварин був підвищений, що може відігравати велику роль в патогенезі аутоімунного процесу.

Література:

1.                   Синяченко О.В. Силикоартрит (обзор литературы) / О.В.Синяченко, В.Г.Дейнега // Гигиена труда и проф..заболевания. – 1981. - № 4. – С. 33-36.

2.                   Потапнев М. П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами / М. П. Потапнев // Иммунология. – 2002. – Т. 23, № 4. – С. 237-243.

3.                   Синяченко О. В. Поражение лёгких при системных заболеваниях соединительной ткани / О. В. Синяченко, М. В. Ермолаева. – Донецк: Юго-Восток, 2005. – 251 с.

4.                   Артамонова В. Г. Силикатозы: особенности медицины труда, этиопатогенез, клиника, диагностика, терапия, профилактика / В. Г. Артамонова, Б. Б. Фишман. – М.; СПб., 2003. – 327 с.

5.                   Лабораторные методы исследования в клинике : справ. / В. В. Меньшиков, Л. Н. Делекторская, Р. П. Золотницкая [и др.]; под ред. Меньшикова. – М.: Медицина, 1987. – 368 с.

6.                   Справочник медицинские лабораторные технологии / под ред. А. И. Карпищенко. – СПб.: Интермедика, 2002. – Т. 2. – 600 с.

7.                   Боровиков В. П. STATISTICA / В. П. Боровиков, И. П. Боровиков. – М.: б. и., 1998. – 583 с.