Dubinina

УДК 618.11-006.6-056.7-07:575.224

В. Г. Дубинина, А. И. Рыбин, О. В. Лукьянчук, О. В. Кузнецова

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ ГЕНОВ BRCA-1 И BRCA-2 У ПЛАТИНОРЕФРАКТЕРНЫХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ

Одесский национальный медицинский университет

Реферат. В. Г. Дубинина, А. И. Рыбин, О. В. Лукьянчук, О. В. Кузнецова. АНАЛИЗ МУТАЦИЙ ГЕНОВ BRCA-1 И BRCA-2 У ПЛАТИНОРЕФРАКТЕРНЫХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ. Рак яичников относится к числу наиболее чувствительных к химиотерапии опухолей, до 30% пациенток с данным заболеванием являются первично-резистентными либо первично-рефрактерными к платиновой химиотерапии. Авторами проведен сравнительный анализ чувствительности пациенток с раком яичников стадии IC-IIIC к адъювантной терапии препаратами платины в зависимости от наличия либо отсутствия мутации генов BRCA-1 и BRCA-2. Показана достоверная положительная корреляция между носительством мутации генов BRCA 1/2 и рефрактерностью злокачественных опухолей яичников к химиотерапии препаратами платины. Мутации указанных генов встречались достоверно чаще у пациенток с рефрактерным к платине раком яичников.

Ключевые слова: рак яичников, лечение, платинорезистентность, мутации генов, BRCA-1, BRCA-2.

Реферат. В. Г. Дубініна, А. І. Рибін, О. В. Лук’янчук, О. В. Кузнєцова. АНАЛІЗ МУТАЦІЙ ГЕНІВ BRCA-1 І BRCA-2 У ПЛАТИНОРЕФРАКТЕРНИХ ХВОРИХ НА РАК ЯЄЧНИКІВ. Рак яєчників належить до числа найбільш сприятливих до хіміотерапії пухлин, до 30% пацієнток з цим захворюванням є первинно-резистентними або первинно-рефрактерними до платинової хіміотерапії. Авторами проведений порівняльний аналіз чуттєвості пацієнток з раком яєчників стадії IC-IIIC до ад’ювантної терапії препаратами платини у залежності від наявності або відсутності мутації генів BRCA-1 і BRCA-2. Показана достовірна позитивна кореляція між присутністю мутації генів BRCA 1/2 і рефрактерністю злоякісних пухлин яєчників до хіміотерапії препаратами платини. Мутації вказаних генів зустрічалися достовірно частіше у пацієнток з рефрактерним до платини раком яєчників.

Ключові слова: рак яєчників, лікування, платинорезистентність, мутації генів, BRCA-1, BRCA-2.

Summary. V. G. Dubinina, А. I. Rybin, О. V. Lukianchuck, О. V. Кuznetsova. ANALYSIS OF BRCA -1 AND BRCA-2 GENES MUTATIONS IN PLATINUM REFRACTIVE PATIENTS WITH OVARIAN CANCER. Ovarian cancer is among the most sensitive to chemotherapy tumors, and 30% of patients with this disease are primary resistant or primary refractory to platinum chemotherapy. The authors carried out a comparative analysis of the sensitivity of patients with ovarian cancer stage IC-IIIC to adjuvant therapy with platinum, depending on the presence or absence of mutations in the genes BRCA-1 and BRCA-2. A significant positive correlation between carriage of mutations in the genes BRCA 1/2, and malignant ovarian tumors refractory to chemotherapy with platinum was shown. Mutations of these genes occurred significantly more often in patients with platinum-refractory ovarian cancer.

Key words: ovarian cancer, resistance to platinum, mutations in genes, BRCA-1,
BRCA-2.

Несмотря на то, что рак яичников (РЯ) относится к числу наиболее чувствительных к химиотерапии опухолей, до 30% пациенток с данным заболеванием являются первично-резистентными либо первично-рефрактерными к платиновой химиотерапии. Даже при выполнении оптимальной циторедуктивной операции и дальнейшем назначении химиотерапии препаратами платины (химиотерапия первой линии) с достижением эффекта полной регрессии и нормализации уровней опухолевых маркеров, 5-летняя выживаемость больных РЯ III стадии составляет 20-25 %, а IV стадии – не превышает 10%. Это означает, что, несмотря на отсутствие клинических признаков заболевания, у подавляющего большинства больных в первые 2-3 года после окончания химиотерапии первой линии следует ожидать прогрессирование заболевания [1; 2; 4; 5; 7; 9-11; 13].

Эффективность платиновых производных при раковых опухолях связана с повреждением ДНК опухолевой клетки, в результате чего формируются так называемые цисплатин–ДНК–аддукты, которые, в свою очередь, блокируют репликацию, транскрипцию и, как результат, клеточную пролиферацию. Клетки с повышенной активностью восстановления ДНК заведомо резистентны к препаратам платины, что подтверждает важность ингибирования репликации ДНК. Некоторое время назад определенное внимание ученых заслужила и митохондриальная ДНК, которая более чувствительна к повреждающему действию платины, чем ядерная. Резистентность к препаратам платины рассматривают как многофакторное явление, обеспечиваемое снижением внутриклеточного накопления цитостатика, повышением активности глутатиона и металлотионеинов, повышением репарации поврежденной ДНК и рядом других процессов [3; 6; 8; 12; 14; 15].

Являются ли данные процессы заранее прогнозируемыми, а следовательно, и предотвратимыми? Существуют ли генетически обусловленные закономерности чувствительности РЯ к препаратам платины? В доступной нам отечественной и зарубежной литературе мы не нашли точных и достоверных данных, позволяющих ответить на этот вопрос.

Цель работы - провести сравнительный анализ чувствительности пациенток с раком яичников стадии IC-IIIC к адъювантной терапии препаратами платины в зависимости от наличия либо отсутствия мутации генов BRCA 1 и BRCA 2.

Материал и методы исследования. С 2007 года на базе отделения онкогинекологии Одесского областного онкологического диспансера был проведен сравнительный анализ 74 клинических случая рака яичников стадии IC-IIIC, которым была выполнена оптимальная либо субоптимальная циторедуктивная операция в объеме пангистерэктомии I типа, оментэктомии с последующей адъювантной химиотерапией препаратами платины. Во всех случаях гистологическим вариантом РЯ была аденокарцинома. Отбор больных для исследования осуществлялся по принципу «случай-контроль». До начала специального лечения всем пациенткам было проведено анкетирование с целью определения клинико-анамнестических характеристик заболевания, а также оценка наличия мутаций BRCA 1 и BRCA 2. Критерием деления пациенток на группы была выбрана чувствительность РЯ к препаратам платины. Первую (основную) группу составили 73 пациентки с рецидивом РЯ в течение трех лет наблюдения, но не менее чем через год после окончания лечения. Вторую (контрольную) группу составили 33 пациентки с отсутствием рецидива заболевания в течение трех лет наблюдения. Исследование проводилось по схеме «случай-контроль». Критерием резистентности к препаратам платины служила регистрация рецидива РЯ путем выполнения компьютерной томографии органов малого таза и определения уровней СА-125 в крови.

В лаборатории молекулярной генетики клиники Одесского национального медицинского университета определяли следующие мутации генов BRCA:

Мутация-1 гена BRCA1, полиморфизм 185delAG

Мутация-2 гена BRCA1, полиморфизм 5382insC

Мутация-1 гена BRCA2, полиморфизм 6174delT

Определение мутация проводилось с помощью метода «SNP-экспресс». Система «SNP-экспресс» представляет собой комплект реагентов для выявления мутаций (полиморфизмов) в геноме человека. Анализу подвергается геномная ДНК человека. С образцом выделенной ДНК параллельно проводятся две реакции амплификации – с двумя парами аллель-специфичных праймеров.

Результаты анализа позволяют дать три типа заключений: нормальная гомозигота; гетерозигота; мутантная гомозигота (рис. 1).

Рисунок 1. Интерпретация результатов анализа, где: К- отрицательный контрольный образец

1 – нормальная гомозигота; 2 – гетерозигота; 3 – мутантная гомозигота.

Исследование проводилось методом ПЦР. Использовались пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл) в соответствии с количеством анализируемых проб плюс отрицательный контроль. Для каждой пробы готовились 2 пробирки: Н (норма) и М (мутация).

Из компонентов комплекта готовили рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси, 0,2 мкл Taq-полимеразы.

Готовили две рабочие смеси: с реакционной смесью НОРМА и с реакционной смесью МУТАЦИЯ.

Добавили по 20 мкл соответствующей рабочей амплификационной смеси во все соответствующие пробирки, подготовленные для амплификации. По 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы вносили в пробирку с рабочей амплификационной смесью НОРМА и в пробирку с рабочей амплификационной смесью МУТАЦИЯ под слой масла. В качестве отрицательного контрольного образца вносится разбавитель в объеме 5 мкл в оба типа реакционной смеси.

Пробирки центрифугировали в течение 3-5 секунд при 1500–3000 об/мин при комнатной температуре на микроцентрифуге-вортексе. Переностли пробирки в прогретый до температуры +94ºС (установившаяся температура в режиме Пауза) программируемый термостат (Плашечный амплификатор C-1000 «BioRad»)и проводили амплификацию по следующей программе:

Таблица 1

Программа амплификации при исследовании мутации генов BRCA

T,Сº

Время

Число циклов

Pause

1 мин

10 сек

20 сек

1 мин

Storage

Детекция продуктов амплификации.

Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза

В аппарате для электрофореза ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ в 50 раз (рН=8,3). Готовили 3% агарозу из расчета на 1 гель: к 1,5 г агарозы 1 мл 50х ТАЕ буфера и 55 мл дистиллированной воды. Приготовленную смесь расплавляли на электрической плите или в СВЧ-печи на небольшой мощности. Добавили 50 мл расплавленной агарозы 5 мкл 1% раствора бромистого этидия. Наносили в карманы геля по 10-15 мкл амплификата в последовательности, соответствующей нумерации проб.

Подключили электрофоретическую камеру к источнику питания и задали напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля Провели электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществлялся визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя прошла от старта 1,5-2 см (оптимальное время разгонки—17 минут).

Для визуализации результатов электрофореза гель из формы перенесли в прибор видеодокументации гелей, проанализировали результаты. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся полос под УФ-излучением с длиной волны 310 нм.

Результаты исследования.

Средний возраст пациенток составил 48±7,3 лет и достоверно не отличался между группами.

Сравнительный анализ распределения РЯ по стадиям в обеих группах показал отсутствие достоверных различий между исследуемыми группами (табл. 2).

Таблица 2

Распределение стадий РЯ у больных исследуемых групп, абс. (%)

*Стадия РЯ*	*Основная группа* (*n=73)*	*Контрольная группа* (*n=33)*	Р
IC	5 (6,8%)	2 (6,1%)	> 0,05
IIA	3 (4,1%)	2 (6,1%)	> 0,05
IIB	2 (2,7%)	1 (3,0%)	> 0,05
IIC	4 (5,5%)	2 (6,1%)	> 0,05
IIIA	19 (26,0%)	8 (24,2%)	> 0,05
IIIB	11 (15,1%)	6 (18,2%)	> 0,05
IIIC	29 (39,7%)	12 (36,4%)	> 0,05

Анализ клинико-анамнестических характеристик пациенток обеих групп показал достоверное отсутствие различий по всем исследуемым показателям (табл. 3), кроме отягощенного генеалогического анамнеза и наличия сопутствующей патологии молочных желез. Достоверно более высокие значения указанных факторов в основной группе свидетельствуют о взаимосвязи наследственной предрасположенностью к возникновению и развитию РЯ и рефрактерностью опухоли.

Таким образом, полученные данные позволяют говорить о том, что исследуемые группы были сформированы рандомизированно и могут быть сравнимы.

Сравнительный анализ мутаций в генах BRCA-1 (5382 insC, 185delAG) и BRCA-2 (6174delT) показал наличие достоверных различий в исследуемых группах (табл. 4).

Таблица 3

Клиническая характеристика групп больных

Рассматриваемый критерий	I группа (основная) n=73		II группа (контрольная) N=33		p
Рассматриваемый критерий	Абс.	%	Абс.	%
Профессиональные вредности	50	68,5	21	63,6	>0,05
Нарушения индекса массы тела	34	46,6	15	45,5%	>0,05
Нарушения менструальной функции	40	54,8	16	48,9	>0,05
Отягощенный репродуктивный анамнез	19	26,0	7	21,2	>0,05
Отягощенный генеалогический анамнез	59	80,8	16	48,5	<0,05
Сопутствующая эндокринная патология	19	26,0	7	21,2	>0,05
Сопутствующая патология молочных желез	40	54,8	13	39,4	<0,05
Сопуствующая патология органов желудочно-кичшеного тракта	29	39,7	11	33,3	>0,05

Таблица 4

Мутации генов BRCA-1 и BRCA-2 в исследуемых группах, абс. (%)

*Исследуемая мутация*	*Основная группа* (*n=73)*	*Контрольная группа* (*n=33)*	Р
Мутация-1 гена BRCA1, полиморфизм 185delAG	56 (76,7%)	12 (36,4%)	<0,05
Мутация-2 гена BRCA1, полиморфизм 5382insC	53 (72,6%)	6 (18,2%)	<0,05
Мутация-1 гена BRCA2, полиморфизм 6174delT	45 (61,4%)	12 (36,4%)	<0,05

Так, мутация-1 гена BRCA-1 (полиморфизм 185delAG) была выявлена у 56 (76,7%) пациенток основной группы и 12 (36,4%) пациенток группы контроля. Мутация -2 гена BRCA-1 (полиморфизм 5382 insC) была обнаружена у 53 (72,6%) пациенток первой группы и 6 (18,2%) женщин группы контроля. Мутация-1 гена BRCA-2 (полиморфизм 6174delT) выявлена у 45 (61,4%) больных первой группы и у 12 (36,4%) больных группы контроля.

Выводы

1. Нами выявлены различные варианты мутаций генов BRCA у пациенток с раком яичников: BRCA-1 (185delAG) – 64,2%, BRCA-1 (5382 insC) – 55,7%, и BRCA-2 (6174delT) – 53,8%.

2. В исследуемых группах не было выявлено достоверной корреляции между стадией заболевания, клинико-анамнестическими характеристиками больных раком яичников и чувствительностью опухоли к препаратам платины.

3. Нами выявлена достоверная положительная корреляция между носительством мутации генов BRCA-1 и BRCA-2 и рефрактерностью злокачественных опухолей яичников к химиотерапии препаратами платины. Мутации указанных генов встречались достоверно чаще у пациенток с рефрактерным к платине раком яичников.

4. По нашим данным, у больных с наследственной предрасположенностью, в т.ч. мутациями генов BRCA-1 и BRCA-2, к возникновению рака яичников чувствительность опухоли к химиотерапии препаратами платины достоверно ниже таковой у больных раком яичников без отягощенной наследственности.

Литература

1. Аксель М. А., Баринов В. В., Бокина Л. И.. Лекции по онкогинекологии. – М.: МЕДпресс-информ, 2009. – 425 с.

2. Бохман Я. В. Лекции по онкогинекологии. – М.: МИА, 2007. – 304 с.

3. Важенин А. В., Жаров А. В., Шимоткина И. Г. Актуальные вопросы клинической онкогинекологиию - М.: СТРОМ, 2010. – 128 с.

4. Винокуров В.Л. Рак яичников: закономерности метастазирования и выбор адекватного лечения больных. – СПб.: Фолиант, 2004. – 333 с.

5. Генетика пухлин жіночих репродуктивних органів / За ред. В. М. Запорожана. — Одеса: ОДМУ, 2004. — 332 с.

6. Запорожан В. М., Цегельський М. Р. Гінекологічна патологія. Атлас: Навч. посібник. – Одеса: ОДМУ, 2002. – 308 с.

7. Запорожан В. М., Цегельський М. Р., Рожковська Н. М. Акушерство і гінекологія. Підручник: У двох томах. – Одеса: ОДМУ, 2005. – 420 с.

8. Клиническая онкогинекология / под ред. В. П. Козаченко. – М.: Медицина, 2005. – 376с.: ил.

9. Корман Д. Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. – М.: Практическая медицина. – 2006. – 503 с.

10. Онкология: национальное руководство / Под ред. В. И. Чиссова, М. И. Давыдова. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 1072 с.

11. Переводчикова Н. И. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. – М.: Медицина, 2005. – 698 с.

12. Урманчеева А. Ф., Тюляндина С. А., Моисеенко В. М. Практическая онкогинекология: Избранные лекции. - СПб.: «ТОММ», 2008. – 400 с.

13. Химиотерапия злокачественных новообразований / Под ред. Э.Чу и В.Т. де Вита (перевод с англ.). – М.: Практика. – 2008. – 447 с.

14. Щепотин И. Б., Бондарь Г. В., Ганул В. Л. Алгоритмы современной онкологии. – Киев: Книга плюс, 2006. - 304 с.

15. Экспериментальная онкология на рубеже веков. /Под ред. М. Н. Давыдова, А. Ю. Барышникова. – М.: Издат. группа РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН. – 2003. –550 с.

Работа поступила в редакцию 05. 01. 2013 года.

Рекомендована к печати на заседании редакционной коллегии после рецензирования